扁平苔藓组纳入的口腔扁平苔藓患者, 根据临床表现和病理学检查, 符合世界卫生组织关于口腔扁平苔藓的诊断标准, 排除患有其他系统性疾病、其他口腔黏膜疾病以及近3个月使用过免疫制剂者。对于符合纳入标准的患者, 详细记录其口腔扁平苔藓病损部位、类型、累计范围等临床资料。社会招募健康成人志愿者作为对照（正常组）用于血清收集, 要求正常组和扁平苔藓组在年龄、性别等基线无统计学差异。扁平苔藓组30例, 对照组15例, 患者知情同意。

外周血样本采集：无菌采集口腔扁平苔藓患者、健康正常对照外周非抗凝血5 mL, 离心分离血清, -80 ℃保存。

组织标本收集：活检法获取口腔扁平苔藓及正常口腔黏膜上皮组织（外科手术中切除的多余正常黏膜组织）, 将活检组织置于10%中性福尔马林溶液中石蜡包埋, 用于组织病理学诊断, 并采用免疫组织化学染色方法检测VEGF、ICAM-1、VCAM-1的表达。患者知情同意。

人ICAM-1/CD54非等位基因特异性酶联免疫试剂盒（R& D Systems, 美国）; 人sVCAM-1/CD106 酶联免疫试剂盒（R& D Systems, 美国）; 人VEGF酶联免疫试剂盒（R& D Systems, 美国）; 免疫组化DAB显色试剂盒（DAKO, 美国）; HRP标记羊抗兔鼠通用抗体（DAKO, 美国）; VEGF鼠单克隆抗体（1:500; Santa Cruz, 美国）、VCAM-1（1:200; Abcam, 美国）、ICAM-1（1:3 000; Abcam, 美国）。

采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中VEGF、ICAM-1、VCAM-1的浓度。根据说明书, 用针对VEGF、ICAM-1、VCAM-1的推荐检测参数, 分别将不同浓度的标准品和实验样本加入相对应的孔中, 室温摇床上震荡孵育, 孵育一定时间后, 将板内液体吸去并向每孔加洗涤工作液400 μ L, 用手轻轻晃动10 s, 然后将板内洗涤液甩出, 并在吸水纸上轻拍, 去除残留液体。重复洗涤操作4次。向每个孔中加入酶标检测抗体, 室温摇床上震荡孵育, 所加体积及孵育时间依检测项目而定。通过洗涤液清洗彻底后, 向每孔中加入显色底物, 封住反应孔, 室温摇床孵育。待一定时间后加入终止液, 其颜色由蓝色变为黄色。终止后30 min内于450 nm 处测量吸光度（OD 值）。所有样品均测定3次取其平均值。

组织经10%中性福尔马林固定, 石蜡包埋制作标本切片。切片脱蜡至水, 置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。切片放入3%过氧化氢液室温避光孵育25 min, PBS洗涤3次, 行血清封闭。轻轻甩掉封闭液, 在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗, 切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液洗涤3次, 每次5 min; 滴加生物素化二抗, 37 ℃孵育50 min。磷酸盐缓冲液洗涤3次, 每次5 min; 滴加DAB显色, 镜下观察, 适时终止; 苏木素复染, 自来水冲洗15 min; 氨水返蓝, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 加拿大树胶或中性树胶封片。所有标本均在同一条件下染色。

免疫组织化学染色结果判读：每例随机选取10个高倍镜视野计数, 染色分值及结果记录如下：染色分值“ 0” （表达缺失）, 分值1（低表达, 阳性细胞数≤ 25%）, 分值2（中度表达, 25% < 阳性细胞数≤ 75%）, 分值3（高表达, 阳性细胞数 > 75%）进行蛋白表达水平研究^{[3, 7]}。

采用SPSS 13.0软件进行数据分析, 组间百分数的比较采用多个独立样本非参数检验（K Independent Samples Tests）, 各组间均数的比较采用t检验, 检验水平为α =0.05。

扁平苔藓组患者与正常组血清中VEGF、ICAM-1、VCAM-1表达水平如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 扁平苔藓组患者和正常组血清中VEGF、ICAM-1、VCAM-1的总量比较 Table 1 Total amount of VEGF、ICAM-1、VCAM-1 in Lichen planus and normal group $\bar{x}$± s, pg/mL 组别 VEGF ICAM-1 VCAM-1 扁平苔藓组 0.145 ± 0.096 278.023 ± 60.133 728.395 ± 207.599 正常组 0.077 ± 0.044 229.127 ± 39.219 598.863 ± 135.687 P值 0.074 0.009 0.035 t值 1.837 2.730 2.167 注 VEGF：血管内皮生长因子; ICAM-1：细胞间黏附分子-1; VCAM-1：血管细胞黏附分子-1。

表1 扁平苔藓组患者和正常组血清中VEGF、ICAM-1、VCAM-1的总量比较 Table 1 Total amount of VEGF、ICAM-1、VCAM-1 in Lichen planus and normal group $\bar{x}$± s, pg/mL

扁平苔藓组患者血清中VEGF浓度与正常组比较, 差异无统计学意义（P > 0.05）; 扁平苔藓组患者血清中ICAM-1、VCAM-1的浓度显著高于正常组, 差异有统计学意义（P < 0.05）。

扁平苔藓组30例具有扁平苔藓临床表现的患者均经病理切片染色证实, 符合扁平苔藓的病理学特点。正常组15例正常组织来源于外科手术中切除的边缘多余的非炎性正常黏膜组织。45例组织均行VEGF、ICAM-1、VCAM-1免疫组化染色。

免疫组化结果显示：VEGF在正常组上皮和固有层中表达少量阳性表达或阴性表达, 而在扁平苔藓组的上皮细胞胞质和固有层淋巴细胞浸润带中均有明显强阳性着色（χ ²=33.632, P < 0.05）（图1）。

图1

Figure 1

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	图1 VEGF在口腔正常组织与扁平苔藓组织中的表达 免疫组化 a：正常组 × 100; b：正常组 × 200; c：正常组 × 400; d：扁平苔藓组 × 100; e：扁平苔藓组 × 200; f：扁平苔藓组 × 400; VEGF：血管内皮生长因子。Figure 1 The expression of VEGF on normal and oral lichen planus tissues IHC

ICAM-1在正常口腔黏膜固有层中呈阴性着色, 本试验中15例全部表达为阴性。而在扁平苔藓的上皮层和固有层淋巴细胞浸润带中均有阳性着色（χ ²=45.000, P < 0.05）（图2）。

图2

Figure 2

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	图2 ICAM-1在口腔正常组织与扁平苔藓组织中的表达 免疫组化 a：正常组 × 100; b：正常组 × 200; c：正常组 × 400; d：扁平苔藓组 × 100; e：扁平苔藓组 × 200; f：扁平苔藓组 × 400; ICAM-1：细胞间黏附分子-1。Figure 2 The expression of ICAM-1 on normal and oral lichen planus tissues IHC

VCAM-1在扁平苔藓组织中表达明显高于正常黏膜组织（χ ²=37.286, P < 0.05）（图3）。

图3

Figure 3

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	图3 VCAM-1在口腔正常组织与扁平苔藓组织中的表达 免疫组化 a：正常组 × 100; b：正常组 × 200; c：正常组 × 400; d：扁平苔藓组 × 100; e：扁平苔藓组 × 200; f：扁平苔藓组 × 400; VCAM-1：血管细胞黏附分子-1。Figure 3 The expression of VCAM-1 on normal and oral lichen planus tissues IHC

血管生成（Angiogenesis）是指机体从已有的微血管床上芽生出新的毛细血管的过程, 在多种生理和病理过程中扮演着重要角色^{[8, 9]}。在肿瘤组织内, 肿瘤细胞也产生某些血管形成因子如bFGF、VEGF等, 引发肿瘤的血管形成, 并对其生物学行为产生重要的影响^[10]。针对扁平苔藓, 以往研究多倾向认为：扁平苔藓病损中伴随着的血管生成与组织内缺氧有关, 而炎症反应则提示了局部淋巴细胞的过度增生^[11]。随着研究深入, 学者发现血管异常增生及内皮细胞的功能失调, 与口腔扁平苔藓慢性炎症息息相关。已有学者采用免疫组织化学法检测到口腔扁平苔藓病损组织的微血管密度高于正常口腔黏膜组织, 其中, 糜烂型口腔扁平苔藓各项指标均高于非糜烂型^[12]。但也有研究证明口腔扁平苔藓不同病理类型间无显著差异^[13]。

研究结果显示：ICAM-1和VCAM-1在口腔扁平苔藓患者血清和组织中的表达均明显高于正常人。虽然在血清中未检测到VEGF的表达差异, 但在局部组织中VEGF表达两组中差异显著, 这可能与本研究中样本量不足有关。一般情况下, ICAM-1和VCAM-1表达于内皮细胞和淋巴细胞中。扁平苔藓组织中两者的高表达可促使血管和淋巴细胞的增加。因此, 推测血管生成在扁平苔藓的免疫炎症反应中起着重要的调节作用, 血管反应是通过激活扁平苔藓内皮细胞活性和炎症因子释放形成的。

ICAM-1是免疫球蛋白家族成员, 可以与整合素-2β 、淋巴细胞相关抗原-1（lymphocyte associated antigen-1, LFA1）以及Mac1结合。血循环中几乎所有的淋巴细胞都表达LFA1, ICAM-1与LFA1结合反应对于淋巴细胞粘附并迁移到炎症区域具有十分重要作用。有研究发现, 口腔扁平苔藓组织中, 微血管密度的增加与ICAM-1高表达密切相关, 提示ICAM-1在淋巴细胞从血循环迁移到局部组织中发挥重要作用^[14]。Little等^[15]研究发现, ICAM-1不仅表达于内皮细胞, 在扁平苔藓的角质层上皮细胞中均检测到有表达, 而在正常上皮层中不表达, 这与本研究的结果相一致。VCAM-1同样属于免疫球蛋白结合家族, 它与整合素-1β 和细胞黏附分子缓慢抗原-4（very late antigen-4, VLA4）结合, 通常存在于记忆性T细胞表面, 在免疫性介导的炎症组织中表达升高^[16]。而ICAM-1和VCAM-1可作为新生血管形成的生理性指标。

VEGF是重要的促血管生长因子, 正常人组织中呈低水平表达, 本试验中在扁平苔藓组织的上皮和淋巴细胞中均有高表达, 提示临床上局部抗VEGF生成治疗有可能成为口腔扁平苔藓的一种替代治疗。巨噬细胞和其它免疫系统内细胞分泌的VEGF可促进血管增殖及内皮细胞迁移^[17]。VEGF在扁平苔藓病损局部的血管生成中起到了重要作用, 而血管生成对于扁平苔藓的病程加重同样发挥着重要作用。抗血管生成疗法已对一些慢性炎症、糖尿病性视网膜病变起到了积极治疗作用, 并逐渐成为肿瘤治疗的新策略^{[18, 19]}。高效且可直接作用于口腔扁平苔藓病灶内的抗血管生成药物有望在口腔扁平苔藓的治疗中发挥积极作用, 具有潜在应用前景。